科研服务

质粒DNA作为基因递送的非病毒载体,在传染性疾病预防性疫苗、肿瘤治疗、蛋白替代治疗等领域有着广泛应用。但治疗性质粒DNA亦面临一些难题,如质粒DNA存在整合到靶标细胞基因组上的风险;质粒DNA序列上存在的CpG基序可能具有免疫刺激效应; 存在于人体中的细菌可能会发生质粒转化,导致质粒DNA复制,从而使体内细菌产生耐药性;此外,用限制性内切酶切割或PCR扩增获得的仅含有转录单位的DNA片段,遇到核酸外切酶极易发生降解。


LC-dsDNA(Linear, covalent closed, double strand DNA),即线性共价闭合双链DNA,在两端具有自由的、非连接的3' 和5'末端,是一种小的、线性双链共价闭合DNA 结构。LC-dsDNA不携带骨架信息,仅表达目的基因,分子量小,细胞转染效率高; 且在抗原的表达及小鼠体内能够触发的体液免疫和细胞免疫的水平媲美质粒DNA疫苗达到的效果,可以提供有效的抵抗病毒感染的保护效力。将 LC-dsDNA 导入目标细胞中,可实现对细胞内特定基因的引入和表达,在临床应用及安全性上有较大优势。


与传统DNA质粒相比,LC-dsDNA具有以下优势:

  • 1)剔除质粒骨架及无关外源序列,降低风险,安全性更高;
  • 2)降低CpG基序,降低触发免疫反应的风险;
  • 3)不受质粒骨架拷贝数影响,产量更高;
  • 4)在哺乳动物体内表达更好,每次转染所需DNA量更少。


与PCR扩增或酶切获得的DNA片段相比,LC-dsDNA 3’末端自身环化,形成共价闭合结构,免受核酸外切酶攻击,稳定性更高。


通用生物拥有专业的基因及质粒生产、工艺开发团队,在科研级LC-dsDNA定制合成方面具有丰富的经验,可提供从基因合成、质粒制备、LC-dsDNA合成一站式服务。 可合成制备200-8000 bp LC-dsDNA ,并可针对不同的下游应用进行优化定制。交付的产品具有高产量、高纯度、低杂质残留等特点,可应用于核酸(DNA、mRNA)疫苗及药物研发、细胞与基因治疗(GCT)等诸多领域的早期研究阶段。

服务内容

服务步骤 服务内容 周期 交付内容
1.基因合成及质粒制备 基因合成、质粒构建 1-2周

a) LC-dsDNA产品

b) COA 文件

c) 序列验证文件

质粒抽提
2.LC-dsDNA合成 体内或体外合成 3-4周
纯化回收
3.质控 默认QC+额外QC项(可定制) 详询

QC项目

QC 项目 检测方法
默认 外观 目测
LC-dsDNA产品序列完整度 琼脂糖凝胶电泳
序列准确性 DNA模板Sanger 测序
LC-dsDNA DNA浓度 Nano drop定量
A260/280 Nano drop定量
内毒素含量 凝胶鲎试剂法
生物负载 TSA 48h平板检测
额外(可选)* 模板DNA残留 qPCR
蛋白残留 ELISA法;BCA蛋白定量;Qubit法(可选)
DNA酶残留 DNase检测
纯度 CE/HPLC
需支付额外QC费用。如需更多其它QC项,可支持定制

服务应用

1)mRNA IVT 的模板


以LC-dsDNA为mRNA体外合成模板,细菌质粒残留是传统方法的1/100以下。通用生物可提供70-150 polyA模板的快速合成服务。


2)基因编辑


LC-dsDNA可作为CRISPR/Cas基因编辑技术中基因敲入的HDR模板。线性闭合末端结构,免受细胞内核酸外切酶攻击,提高编辑效率,同时闭合结构降低非同源末端连接的风险。


3)基因治疗非病毒载体


作为基因递送的非病毒载体,LC-dsDNA具有更高的载量,更大的转基因能力,毒性低,免疫原性反应小,安全性更高。

案例展示

LC-dsDNA合成


图a.大肠杆菌体内诱导合成LC-dsDNA琼脂糖凝胶电泳检测


图b. LC-dsDNA纯化后凝胶电泳

注. 图a. 1、2为诱导前质粒DNA凝胶电泳检测;3、4、5、6为诱导后DNA凝胶电泳检测

注. 图b. 7、8、9、10为4个样本纯化后凝胶电泳检测.


LC-dsDNA纯度检测


图c. Agilent 5200 分析仪检测LC-dsDNA纯度

Agilent 5200 分析仪检测纯度达96.8%。


细胞转染鉴定



LC-dsDNA EGFP转染24h

          

mRNA-EGFP 转染24h

经转染293T细胞表达鉴定,LC-dsDNA EGFP表达水平与mRNA-EGFP相近,均实现高表达

订购信息

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